Para impedir a destruição de mais reduções, os jesuítas passaram a destacar integrantes que antes haviam sido militares, dentre eles os irmãos: Juan Cárdenas, Antônio Bernal e Domingo Torres para treinar os índios, conseguindo ainda armas de fogo para defender as reduções de novos ataques dos bandeirantes. Os jesuítas Pedro Mola, Cristóvão de Altamirano, Juan de Porras, José Domenech, Miguel Gómez, Domingo de Salazar, Antônio de Alarcón, Pedro Sardoni e Domingo Suárez organizaram a construção de balsas. O comando militar seria dos caciques Ignácio Abiarú, Nicolás Nhienguirú, Francisco Mbayroba e Azaray.
Além disso, conseguiram fazer com que o Papa Urbano VIII assinasse uma Bula que excomungava àqueles que caçavam nativos das reduções jesuíticas para escravizá-los. Esse documento não foi bem recebido em São Paulo, pois a cidade tinha como principal atividade econômica a caça de nativos da etnia guarani para revendê-los como escravos aos senhores de engenho do nordeste do Brasil.
O jesuíta Antônio Ruiz de Montoya que liderava as Missões no oeste do Paraná, que foram destruídas pelos bandeirantes, foi recebido pelo Rei de Espanha Don Felipe IV e, no dia 21 de maio de 1640, o Soberano autorizou o Vice Rei do Peru a fornecer armas aos guaranis e condenou a escravização de nativos. O governador de Buenos Aires, Pedro de Rojas y Acevedo, temendo a expansão portuguesa, enviou instrutores e armas para ajudar a defesa dos guaranis.
Em meados de 1640, o jesuíta Francisco Díaz Taño, então Procurador da Província Jesuítica do Paraguai, durante seu retorno da Europa, fez publicar no RJ a referida Bula Papal e a condenação daqueles que escravizavam nativos. Na época, ainda estava em vigor a União Ibérica, circunstância na qual o Rei da Espanha, também era o Rei de Portugal.
A publicação gerou uma revolta dos habitantes de cidades como o Rio de Janeiro, Santos, São Vicente e São Paulo contra os jesuítas. Houve uma reunião na Câmara Municipal de São Paulo na qual foi organizada uma expedição para atacar e destruir as reduções jesuíticas, vingar a derrota do bandeirante Pascoal Leite Pais em Caazapaguazú, prender os jesuítas e devolvê-los para a Espanha.
No início de setembro de 1640, partiu de São Paulo uma grande bandeira com cerca de 3.500 homens, liderados por Jerônimo Pedroso de Barros e Manuel Pérez. Dentre eles Antônio de Cunha Gago, Juan Leite e Pedro Nunes Dias. No final de 1640, chegou aos jesuítas, por intermédio de Francisco Díaz Taño, a informação de que a bandeira estava a caminho para destruir muitas reduções. Porém eles já contavam com um força estimada em 4.200 homens, centenas de canoas e inclusive uma balsa com uma peça de artilharia.
Embora a maioria estivesse armada apenas com arcos e flechas, contavam com cerca de 300 arcabuzes e algumas peças de artilharias enviadas de Buenos Aires. Em 08/01/1641, ao saber do acampamento dos bandeirantes, o Padre Cláudio Ruyer ordenou o agrupamento do exército guarani nas proximidades do Arroio Mbororé, na margem ocidental do Rio Uruguai, em território que atualmente pertence à Província de Misiones, na Argentina.
No dia 25/02/1641, 8 canoas foram enviadas rio acima para coletar informações sobre o avanço dos bandeirantes. Esses guaranis tiveram uma escaramuça com os invasores e ao fugir foram perseguidos por canoas tripuladas por nativos da etnia tupi, mas foram salvos quando se aproximaram do restante do contingente guarani.
A batalha principal teve início no dia 11/03/1641, e durou cerca de 5 dias. Os bandeirantes contavam com cerca de 700 canoas. Algumas armas empregadas pelos guaranis eram bastante curiosas como uma catapulta que arremessava troncos em chamas e canhões de taquaruçu revestidos de couro que podiam disparar até 4 vezes. Os bandeirantes foram derrotados na batalha fluvial e depois tiveram o acampamento cercado e foram perseguidos durante a fuga, desse modo apenas cerca de 120 integrantes da expedição conseguiram retornar à São Paulo.
Inconformados, eles organizaram uma 2ª expedição que chegou na região no final de 1641 e conseguiu agrupar alguns elementos da primeira expedição que estavam escondidos nas matas. Fizeram um novo acampamento nas margens do Rio Yabotí Guazú mas foram atacados e forçados a fugir. Depois dessa derrota, os bandeirantes deixaram de atacar as reduções dirigidas pelos jesuítas freando a expansão da América Portuguesa em direção ao sul, entretanto anos depois ocorreriam novos ataques contra as reduções situadas na região do Itatim, que corresponde ao oeste do atual território do Estado do Mato Grosso do Sul.
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